Abstract Objective: This clinical study sought to evaluate the effectiveness of passive ultrasonic activation (PUA) in eliminating microorganisms in primary endodontic infection (PEI) after instrumentation of root canals using microbiological culture and checkerboard DNA-DNA hybridization. Methodology: Twenty root canals with PEI and apical periodontitis were selected. The root canals were instrumented and then randomly divided into 2 groups, according to the irrigation method: PUA and conventional needle irrigation (CNI). Microbiological samples were collected before instrumentation (S1), after instrumentation (S2) and after irrigation with 17% EDTA (S3). The samples were subjected to anaerobic culture technique and checkerboard DNA-DNA hybridization analysis. Results: A statistically significant difference was found between CNI (23.56%) and PUA (98.37%) regarding the median percentage values for culturable bacteria reduction (p<0.05). In the initial samples, the most frequently detected species was S. constellatus (50%), and after root canal treatment was E. faecalis (50%). Conclusion: Both treatments significantly decreased the number of bacterial species compared with the initial sample. However, no statistical difference in the total microbial load between PUA and CNI groups was detected. The number of cultivable anaerobic bacteria reduced significantly using PUA, and the bacterial composition and number of bacterial species after using either CNI or PUA was similar.

Resumo Este estudo foi realizado para investigar o perfil microbiano e os níveis de endotoxina de lesões endoperiodontais de origem periodontal. Amostras periodontais e endodônticas foram obtidas de bolsas periodontais e canais radiculares necróticos de 10 dentes com lesões endoperiodontais. A investigação de 40 espécies bacterianas diferentes foram determinadas em cada amostra endodôntica e periodontal usando o método de hibridização de DNA-DNA (checkerboard) e o ensaio cinético cromogênico LAL foi usado para quantificação de endotoxinas. O teste exato de Fisher correlacionou as espécies bacterianas com a microbiota endodôntica ou periodontal. Os níveis de endotoxina (EU/mL) encontrados nas amostras do canal radicular e na bolsa periodontal foram comparados pelo teste de Wilcoxon (p<0,05). Bactérias e unidades de LPS foram encontradas em 100% das amostras endodônticas e periodontais. As espécies E. faecium, P. acnes, G. morbillorum, C. sputigena e L. buccalis foram fortemente correlacionadas com a microbiota endodôntica e P. nigrescens com a microbiota periodontal. P. intermedia, P. endodontalis e V. parvula foram mais prevalentes em ambas microbiotas endodôntica e periodontal. Os níveis de endotoxina na bolsa periodontal (89600 EU/mL) foram significativamente maiores do que no canal radicular (2310 EU/mL). Concluiu-se que a microbiota presente nos tecidos periodontal e endodôntico é semelhante, com maior prevalência de espécies do complexo laranja e maior nível de endotoxina nas bolsas periodontais.

Abstract This study was carried out to investigate the microbial profile and endotoxin levels of endodontic-periodontal lesions of periodontal origin. Periodontal and endodontic samples were taken from periodontal pockets and necrotic root canals of 10 teeth with endodontic-periodontal lesions. Evidencing of 40 different bacterial species were determined in each endodontic and periodontal sample using the checkerboard DNA-DNA hybridization method and Kinetic chromogenic LAL assay was used for quantification of endotoxins. Fisher’s exact test correlated the bacterial species with the endodontic or periodontal microbiota. The endotoxin levels (EU/mL) found in samples of the root canal and periodontal pocket were compared by the Wilcoxon test (p<0.05). Bacteria and LPS units were found in 100% of the endodontic and periodontal samples. The species E. faecium, P. acnes, G. morbillorum, C. sputigena and L. buccalis were strongly correlated with the endodontic microbiota and P. nigrescens with the periodontal microbiota. P. intermedia, P. endodontalis and V. parvula were more prevalent in both endodontic and periodontal microbiots. The endotoxin levels in the periodontal pocket (89600 EU/mL) were significantly higher than in the root canal (2310 EU/mL). It was concluded that the microbiota present in the periodontal and endodontic tissues is similar, with a higher prevalence of species of the orange complex and a higher level of endotoxin in the periodontal pockets.

Resumo Este estudo clínico foi conduzido para correlacionar os níveis de endotoxinas e bactérias cultiváveis encontradas na infecção endodôntica primária (IEP) com o volume do canal radicular determinado pelo uso da Tomografia Computadorizada de Feixe Cônico (TCFC); e avaliar a diversidade bacteriana correlacionada com características clínicas. Vinte pacientes com IEP foram selecionados e as características clínicas foram registradas. O volume (mm3) do canal radicular foi determinado pela análise TCFC. As amostras do canal radicular foram analisadas usando o teste cinético de análise LAL para determinar os níveis de endotoxinas e técnicas anaeróbicas para determinar a contagem bacteriana (UFC/mL). O DNA foi extraído de todas as amostras para determinar a diversidade bacteriana e quantificado utilizando o teste Checkerboard-DNA-DNA-Hybridization. Bactérias cultiváveis e endotoxinas foram detectadas em 100% das amostras do canal radicular. A análise de regressão linear revelou uma correlação entre o volume do canal radicular e a presença de bactérias anaeróbicas (p<0,05). Foram encontradas correlações positivas entre espécies de bactérias e presença de diferentes características clínicas (p<0,05). Após agrupamento das espécies dos micro-organismos em complexos bacterianos, foram encontradas associações positivas entre os complexos verde, laranja e vermelho com presença de fístula (p<0,05). Este estudo clínico revelou que os canais radiculares mais amplos possuem níveis mais elevados de bactérias cultiváveis na IEP. Assim, a interação de diferentes espécies de bactérias virulentas em complexos parece desempenhar um papel importante no desenvolvimento de características clínicas.

Abstract This clinical study was conducted to correlate the levels of endotoxins and culturable bacteria found in primary endodontic infection (PEI) with the volume of root canal determined by using Cone Beam Computed Tomography (CBCT); and to evaluate the bacterial diversity correlating with clinical features. Twenty patients with PEI were selected and clinical features were recorded. The volume (mm3) of root canal was determined by CBCT analysis. Root canal samples were analyzed by using kinetic LAL-assay test to determine the levels of endotoxins and anaerobic technique to determine the bacterial count (CFU/mL). DNA was extracted from all samples to determine bacterial diversity and quantified by using Checkerboard-DNA-DNA- Hybridization. Culturable bacteria and endotoxins were detected in 100% of the root canal samples. Linear regression analysis revealed a correlation between root canal volume and presence of anaerobic bacteria (p<0.05). Positive correlations were found between bacteria species and presence of different clinical features (p<0.05). After grouping the bacteria species into bacterial complexes, positive associations were found between green, orange and red complexes with presence of sinus tract (p<0.05). This clinical study revealed that larger root canals hold higher levels of culturable bacteria in PEI. Thus, the interaction of different virulent bacteria species in complexes seems to play an important role in the development of clinical features.

Resumo Este estudo clínico investigou os efeitos do tratamento endodôntico com uso de diferentes irrigantes (NaOCl + água de cal e NaOCl + polimixina B) e medicação intracanal sobre endotoxinas em dentes com infecção endodôntica primária e presença de lesão periapical visível radiograficamente. Foram selecionados para o estudo trinta e três dentes de pacientes que apresentavam necrose pulpar e presença de lesão periapical. As amostras foram coletadas após a abertura coronária (S1) e após a instrumentação (S2). Os canais radiculares foram divididos em 3 grupos (n = 11) de acordo com a combinação de irrigantes utilizada: NaOCl + LW:- hipoclorito de sódio 2,5% + solução de hidróxido de cálcio (água de cal 0,14%); NaOCl + PmB: hipoclorito de sódio a 2,5% + polimixina B 10.000 UI/mL; NaOCl (controle): hipoclorito de sódio a 2,5%. A terceira coleta (S3) foi realizada após aplicação do ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA) e a quarta coleta (S4) após 14 dias de medicação intracanal de hidróxido de cálcio + clorexidina gel 2%. Endotoxinas (lipopolissacarídeos) foram quantificadas pelo ensaio cromogênico do lisado de amebócitos de Limulus (LAL). Endotoxinas foram detectadas em todos os canais radiculares após abertura coronária (S1). Grupo NaOCl + PmB apresentou a maior redução de endotoxinas após a instrumentação (76,17%), sendo similar ao grupo NaOCl + LW (67,64%, P >.05) e diferente do grupo NaOCl (42,17%, P <.05). Após o período de medicação intracanal, houve aumento significativo da neutralização de endotoxinas. Concluiu-se que NaOCl + PmB promoveu a maior redução dos níveis de endotoxinas, seguido de NaOCl + LW. A medicação intracanal não teve um papel complementar significativo na redução de endotoxinas no final do tratamento.

Abstract This clinical study investigated the effects of endodontic treatment by using different irrigants (limewater + NaOCl and polymyxin B + NaOCl) and intracanal medication on endotoxins in teeth with primary endodontic infection and radiographically visible apical periodontitis. Thirty-three teeth with necrotic pulp and periapical lesions from different patients were selected for this study. Samples were collected after the coronal opening (S1) and after instrumentation (S2). Root canals were divided in 3 groups (n = 11) according to the irrigant combination used: NaOCl + LW: 2.5% NaOCl + calcium hydroxide solution (0.14%, limewater); NaOCl + PmB: 2.5% NaOCl + 10.000 UI/mL polymyxin B; 2.5% NaOCl (control). The third sampling (S3) was performed after ethylenediaminetetraacetic acid and the fourth (S4) after samples got 14 days with intracanal medication with 2% chlorhexidine gel + calcium hydroxide. Endotoxins (lipopolysaccharide) were quantified by chromogenic Limulus amebocyte lysate (LAL). Endotoxins were detected in all root canals after the coronal opening (S1). NaOCl + PmB group presented the greatest endotoxin reduction after instrumentation (76.17%), similar to NaOCl + LW group (67.64%, p<0.05) and different from NaOCl group (42.17%, p<0.05). After intracanal medication period (S4), there was significant increase of endotoxins neutralization. It was concluded that NaOCl + PmB promoted the greatest reduction of endotoxin levels, followed by NaOCl + LW. Intracanal medications had no significant complementary role in the reduction of endotoxins at the end of the treatment

Resumo Este estudo clínico investigou e quantificou bactérias cultiváveis e seus níveis de endotoxinas na infecção endodôntica persistente, determinando a sua antigenicidade contra macrófagos e células de fibroblastos através de IL-1β e TNF-α; e avaliando sua relação com características clínicas e radiográficas. As amostras dos canais radiculares foram obtidas após a desobturação. Técnicas de cultura foram utilizadas para determinar a contagem de bactérias e a quantificação de endotoxinas foram determinadas por ensaio de LAL. Análise por PCR (16S rDNA) foi utilizada para a detecção bacteriana. Células 264,5 macrófagos e fibroblastos V79 foram estimuladas com conteúdo endodôntico. IL-1β e TNF-α produzidas pelas células avaliadas foram medidas por ensaio de ELISA. As medianas de bactérias e endotoxinas foram 1,24x105 UFC/mL e 9,62 EU/mL, respectivamente. Porphyromonas endodontalis foi a espécie mais frequentemente detectada. Níveis mais elevados de endotoxinas foram encontrados em dentes com dor à palpação (23,56 EU/mL) quando comparado a sua ausência (8,21 EU/mL). Maiores áreas de destruição óssea foram relacionados com níveis mais elevados de endotoxinas e IL-1β e TNF-α. O estudo revelou presença de espécies de bactérias Gram-negativas em infecção endodôntica persistente, com níveis elevados de endotoxinas relacionados a maior destruição óssea periapical e presença de sintomatologia. Além disso, grandes áreas de destruição óssea foram relacionados com níveis mais elevados de IL-1β e TNF-α secretadas por macrófagos e fibroblastos.

Abstract This clinical study investigated and quantified cultivable bacteria and their levels of endotoxins in persistent endodontic infection, determining their antigenicity against macrophages and fibroblast cells by IL-1β and TNF-α secretion and evaluating their relationship with clinical and radiographic features. Samples from the root canals were obtained after root filling removal. Culture techniques were used to determine the bacterial count and the endotoxins were determined by LAL-assay. PCR analysis (16S rDNA) was used for bacterial detection. Raw 264.5 macrophages and V79 fibroblast were stimulated with endodontic contents. ELISA assay measured the amounts of IL-1ß/TNF-?#61537; secretion. Bacteria and endotoxin medians were 1.24x105 CFU/mL and 9.62 EU/mL, respectively. Porphyromonas endodontalis was the most frequently detected species. Higher levels of endotoxins were found in teeth with pain on palpation (23.56 EU/mL) rather than in its absence (8.21 EU/mL). Larger areas of bone destruction were related to higher levels of endotoxins and IL-1β and TNF-α secretion. The study findings revealed the presence of Gram-negative bacteria species in persistent endodontic infection, with their endotoxins related to both severity of bone destruction and development of symptomatology. Moreover, larger areas of bone destruction were related to higher levels of IL-1β and TNF-α secreted by macrophages and fibroblast cells.